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自烈冰生物關(guān)鍵技術(shù)——冷凍切片制備亮相以后，很多老師都對烈冰的空間轉(zhuǎn)錄組測序保持極大地關(guān)注，尤其之前小編請到了實驗團隊大神Dr.Han親自上手，結(jié)合實際操作詳細介紹了樣本制備的整個過程，老師們紛紛反饋注意到了很多之前忽略的細節(jié)操作。
那么，本期小編就持續(xù)高能輸出技術(shù)干貨，介紹一下烈冰生物的數(shù)字切片掃描成像方案以及空轉(zhuǎn)實驗的核心步驟——組織透化優(yōu)化，全程高能，做好準(zhǔn)備哦~
掃描成像的分辨率是影響組織切片原始圖像信息精度和準(zhǔn)確度的重要因素。將組織切片掃描為包含所有組織信息的高分辨率電子圖片，可以在電腦上進行放大和縮小，如同在顯微鏡上操作一樣，真正將物質(zhì)的切片標(biāo)本快速數(shù)字化，實現(xiàn)病理數(shù)字閱片。
組織透化是指將組織切片放置在含有與 RNA 結(jié)合捕獲探針的載玻片上,固定染色后，通過透化酶處理的方式,使細胞中的 mRNA 釋放并結(jié)合到相應(yīng)的捕獲探針上,從而獲取基因表達信息。 這個過程需要對透化時間進行一個很好的把控，透化時間不夠，mRNA無法充分釋放出來；透化時間過長，mRNA可能會擴散到附近區(qū)域，影響分析結(jié)果的準(zhǔn)確性。根據(jù)實驗人員的操作手法、組織類型、切片厚度等因素不同，最佳透化時間也不盡相同。因此在正式的組織透化實驗之前，通常需要對組織進行透化優(yōu)化，以確定最佳透化時間。
下面就以腦組織的冷凍切片為例詳細介紹一下組織透化時間的優(yōu)化過程。
首先，準(zhǔn)備好組織優(yōu)化的冷凍切片，進行固定、HE染色，然后在明場光源下進行掃描成像。
固定及HE染色具體步驟：
1 ）將芯片放在PCR儀上，37°C下孵育1分鐘。
2 ）將芯片完全浸入預(yù)冷的甲醇中在-20°C孵育30分鐘。
3 ）玻片取出，擦干背面液體，在玻片上滴加500μl異丙醇，室溫孵育1分鐘；
4 ）將芯片上試劑去除，晾干玻片；
5 ）加入1 ml蘇木精，室溫孵育7分鐘；
6 ）去除蘇木精試劑，然后將芯片先浸入無酶水中清洗后，晾干；
7 ）加入1 ml Bluing Bu?er，室溫孵育2分鐘；
8 ）去除試劑，將芯片浸入無酶水清洗后，擦干玻片背面液體；
9 ）加入1 ml伊紅混合物，室溫孵育1分鐘；
10） 去除試劑，將芯片浸入無酶水中清洗，晾干直至組織不透明。
11 ）在37°C下孵育芯片5分鐘后，進行明場成像實驗。
組織透化優(yōu)化：
組織優(yōu)化芯片包含8個捕獲區(qū)域：
組織透化具體步驟:
1）將芯片放在芯片盒中，陽性和陰性對照均不加透化酶。
2 ) 在透化30min的孔中添加70μl透化酶，放置在37°C的PCR適配器上。
3 ) 6分鐘后，向透化24min的孔中添加70μl通透酶，并在37°C的PCR適配器上孵育，
4) 重復(fù)此過程，直至27min后，向透化3min的孔添加70μl透化酶，放置在37°C的PCR適配器上。
5) 從每個孔中除去透化酶，陽性對照以外的所有孔中添加100μl 0.1X SSC，
6) 從每個孔中移出0.1X SSC。向每個孔中加入50μl Fluorescent RT Master Mix，將其放在預(yù)熱的PCR儀（設(shè)置條件）以啟動cDNA合成。
7) 從孔中吸出Fluorescent RT Master Mix，向每個孔中添加100μl 0.1X SSC，
8) 從每個孔中吸出0.1X SSC。向每個孔中加入70μl Tissue Removal Mix，然后放在PCR儀適配器上孵育，
9) 從孔中吸出Tissue Removal Mix。從芯片盒中取出芯片，浸入預(yù)熱的2X SSC-0.1％SDS中15次，浸入0.2X SSC中15次，浸入0.1X SSC中15次。
10) 在載片旋轉(zhuǎn)器中離心30s，確認(rèn)芯片上沒有剩余的組織。
通過數(shù)字切片掃描儀在熒光場下進行掃描成像。可以明顯看出隨著透化時間的延長，熒光強度先逐漸增強，透化12min時熒光亮度達到最亮，而后逐漸減弱。
如果熒光強度接近，可以選擇較長的透化時間，防止透化不充分。但透化時間并不是越長越好，隨著時間增加，細胞內(nèi)釋放的RNA會擴散，進入附近組織區(qū)域，放大看到海馬區(qū)結(jié)構(gòu)模糊，或向邊緣擴散，沒有熒光信號的區(qū)域也出現(xiàn)了熒光信號。所以，在選擇最佳透化時間時，應(yīng)綜合考慮熒光強度以及RNA擴散程度。
選擇最佳的透化時間后，就可以進行正式實驗了。正式實驗流程與組織透化優(yōu)化的實驗流程基本一致，只是所用芯片不一樣。正式實驗用的基因表達芯片上有4個捕獲區(qū)域，其實驗流程為：
冷凍切片及貼片→甲醇固定→HE染色→明場拍照→透化→cDNA合成→第二鏈cDNA合成→變性→cDNA擴增→純化和質(zhì)控→片段化，末端修復(fù)，加A→連接頭→樣本index PCR→上機測序。
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